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结合重盐的测序法实验流程（BSP） （Bisulfite Genomic Sequence） 原理：结合重盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA化模式的方法。重盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的化状态。该方法特点是： 1. 特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究化的分析方法所不能比拟的； 2. 灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的化位点分布图。 |
图1 结合盐的测序法流程图。DNA用重盐处理后进行PCR扩增，扩增片段纯化后连接进载体，转化大肠杆菌，过夜培养后挑单个阳性克隆进行测序。得到每个DNA分子特定区域化位点的分布图。
结合重盐测序法技术实验流程
A．DNA制备
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重盐处理
C．DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重盐处理后的DNA样品。
D．DNA脱磺基反应
E．PCR扩增
F．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化，随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。
化特异性的PCR实验流程
（methylation-specific PCR, MSP）
原理：化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的化研究方法。重盐处理DNA后，基因组DNA发生的由化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非化DNA链（引物对U）。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在化（图3）。该方法优点是：
l 检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA，可用于石蜡包埋样本；
l 快速、简单，省时；
l 如果结合Real-time定量PCR技术（Taqman 探针）则能对样品中检测位点的化水平进行定量检测(Methylight)。
图2 化特异性的PCR（MSP）流程示意图。用盐处理后DNA分子发生了由化状态决定的序列改变。用化特异性的引物（primer M）和非化特异性的引物（primer U）进行扩增。只有结合完全的化或
MSP技术实验流程
A．DNA抽提
用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B. 重盐处理
C．DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重盐处理后的DNA样品。
D．DNA脱磺基反应
E．化特异性的PCR反应
针对改变后的DNA序列设计两对引物（M，U），进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。
实例：
检测肝癌细胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因启动子化。重盐处理后，针对改变的DAN序列设计两对引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp
图3 Bel 7404细胞系SFRP1基因启动子被完全化，Bel 7405细胞系该基因启动子被部分化。
newweek2012.cn.b2b168.com/m/